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DIAGRAMA DE BLOQUES

GLOSARIO

Aislamiento: Separación de microorganismos de su medio natural o de microorganismos distintos.

Biofertilizantes: Organismos vivos que son usados en agricultura como fertilizantes. Son naturales y no contaminantes para el medio ambiente.

Bloom: Crecimiento denso de algas planctónicas que dan un color característico a la masa de agua.

Tricomas: Conjunto formado por las células ordenadas de forma lineal de una cianobacteria filamentosa.

Exopolisacaridos: Carbohidratos formados por tres o más azucares simples, localizados fuera de la pared bacteriana.

Biofertilizantes: Organismos vivos que son usados en agricultura como fertilizantes. Son naturales y no contaminantes para el medio ambiente.  

Caracterización: Recopilación de los datos básicos de microorganismos para su identificación.

Exopolisacáridos: Carbohidratos formados por tres o más azúcares simples, localizados fuera de la pared bacteriana.

Fitoplancton: Conjunto de los organismos acuáticos autótrofos, que tienen capacidad fotosintética y que viven dispersos en el agua.

Inhibición: Es la suspensión de una función o actividad del organismo mediante la activación de un estímulo.

Microalgas: Organismos fotoautótrofos obligados, es decir, requieren de la energía proveniente de la luz para realizar sus procesos biológicos. Forman parte del fitoplancton.  

Tricoma: Conjunto formado por las células ordenadas de forma lineal de una Cianobacteria filamentosa.

Material a utilizar

Material:

Filtros con miliporos de una medida de 8 micrómetros Micro pipeta Medio de cultivo BG-110 Microscopio Óptico Hisopo delgado Mecheros Placas Petri Cámara de crecimiento Focos fluorescentes

Aireador aquafish 500 Cristal violeta                                                                                    Portaobjetos Agua destilada                                                                                Toallitas de Papel Decolorante (mezcla de alcohol acetona)                                      Microscopio compuesto Safranina           ASAS BacteriológicasPuente de Tinción y Cristalizador Mechero de Fisher

Pruebas de identificación

Se deben tomar datos cada tercer día para un mejor control, al igual que siempre tiene que estarce monitoreando la temperatura. La fuente de luz obtenida por los focos fluorescentes debe mantenerse en un periodo de 12:12 h y el oxígeno debe estar continuamente durante el crecimiento de la Anabaena sp.

Para la caracterización de la Anabaena sp. se basara en la descripción de sus características, debe ser comparada con la literatura [Manual de Bergey (Boone y Castenholz, 2001)], como soporte a la Anabaena se debe cuantificar la clorofila a, proteínas y expolisacaridos tomando una muestra del tratamiento considerando óptimo para el crecimiento de la Anabaena sp.

Descripción 1. Caracterización de la Anabaena sp.
* Las células vegetativas se encuentran en forma esférica, separadas por constricciones bien diferenciadas en la pared celular.
* Las células terminales tienen forma cónica.
* La coloración celular es verde clara con una ligera coloración azulada-
* El diámetro celular tiene un promedio de 4.64+/0.1 m.
* Los heterocistos tienen forma esférica y se encuentran de forma intercalada entre células vegetativas.
* No hay presencia de acinetos.

Descripción 2. Morfología de colonias.
* No se observa formación de colonias 
* Algunos tricomas se observan rectos y otros ligeramente sinuosos y sus células terminales tienen forma cónica.
* Los heterocitos se encuentran intercaladamente con un promedio de 20+-3.61 células vegetativas entre heterocistos.

Técnicas de aislamiento

Para aislar la bacteria es recomendable utilizar el medio de cultivo BG-110, ya que es el medio específico para las cianobacterias, debido a su composición (la tabla 1. anexos). Al eliminar el NaCO3 del medio, se reduce la posibilidad de que cianobacterias no fijadoras de nitrógeno crezcan en el medio de cultivo. Para facilitar el aislamiento de Anabaena sp., se debe solidificar el medio con agar.

A partir del cultivo mixto, se debe proseguir con el aislamiento de la Anabaena. Para esto se debe utilizar un microscopio con lente de aumento 5x donde se debe identificar la colonia de Anabaena sp. en la caja Petri. Co ayuda de un hisopo delgado se debe tomar la parte de la colonia y sembrar en un nuevo medio BG-110 sólido. El aislamiento está basado en el método de Broker y Walsby.

Una vez establecida la cianobacterias en el medio de cultivo sólido (puede tardar 5 semanas), se debe de asegurar la purificación del cultivo, volviendo a colectar cepas de Anabaena sp. y cultivándolas en medio sólido.

Ya aislada la cianobacteria, se debe cultivar en un medio liquido BG-110 en cámara de crecimiento con control de temperatura, luz y aereación (tabla 2. anexos)  hasta alcanzar la fase exponencial con una densidad celular de 1425 cél/L.

ANEXOS:

Componente	Composición masa (g)
K2HPO4	0.04 g
MgSO4.7H2O	0.075g
CaCl2.2H20	0.036g
Ácido citrico	0.006g
Citrato férrico de amonio	0.006g
Na2-EDTA	0.001g
Na2CO3	0.02g
Trace elemento solución	1.0g
H3BO3	2.86g
MnCl2. 4 H2O	1.81g
ZnSO4.7H2O	0.222g
Na2MoO4.2H2O	0.39g
CuSO4.5H2O	0.079g
Co(NO3)2.6H2O	0.494g
Agar -agar	10-15g

Tabla 1. Composición del medio BG-110 

Condiciones de crecimiento
Temperatura	30,32 +- 1, 37°C
pH	7,82 +- 0,15
Oxigeno (mañana)	4,05 +- 0,69 mg/L
Oxigeno (tarde)	4,25 +- 0,65 mg/L

Tabla 2. Las condiciones en las cuales crecen mejor las bacterias.

Medios de cultivo a utilizar

Para iniciar el cultivo de la Anabaena sp, primero se constató la presencia en la muestra tomada con ayuda del microscopio óptico.

En la muestra extraída se debe observar un coctel de microalgas, para esto se necesita realizar un cultivo mixto donde se valla a sembrar la muestra, todo esto para hacer la identificación de la Anabaena sp. más sencilla.

Para cultivar la muestra extraída se debe filtrar con ayuda de filtros con miliporos de una medida de 8 micrómetros y hacerle múltiples lavados con un medio estéril.

Con ayuda de una micropipeta se debe tomar 1 mL de la muestra retenida en el filtro y debe sembrarse en un medio sólido y medio líquido.

Medio solido

HÁBITAT "Aislamiento del microorganismo"

La muestra se pretende aislar en la bahía de Manzanillo, ya que está catalogado como el puerto con mejor clima del Pacífico mexicano, el aislamiento será específicamente de la playa “La Boquita” debido a sus condiciones ambientales en la que esta se encuentra. Su clima es cálido (con humedad mínima), por lo que presenta una temperatura media anual entre 26° y 28° C y de 22 a 23ºC la más baja. Durante el verano se llegan a registrar temperaturas muy elevadas de 30 a 34ºC. 

Se pretende recolectar la muestra durante un bloom, es decir, un crecimiento masivo de micro algas, donde domina la Anabaena sp. Para esto se tiene que buscar un cuerpo de agua que presente una pequeña coloración verdulesca y un fuerte olor a choclo, ya que estos factores son los que caracterizan a un bloom de Anabaena sp. 
Al tomar la muestra no debe de olvidarse de medir la salinidad y el oxígeno disuelto.

Toma de muestra

Caracterización de la Anabaena sp.

• Célula procariota confirmaron su ubicación dentro del reino procarionte.
• Las células vegetativas se encuentran en forma esférica, cilíndricas, o en forma de barril con diámetros de 3 a 6 µm y estas se encuentran separadas por constricciones en la pared celular.
• Las células terminales tienen forma cónica. .
• Los acinetos se los puede encontrar separados o agrupados (2-3), junto a heterocistos o distantes de ellos.
• La membrana no es firme pero la producción de mucilágeno puede ser abundante.
• La coloración celular es verde clara con una ligera coloración azulada.
• El diámetro celular tiene un promedio de 4.64+/0.1 µm
• Los heterocistos tienen forma esférica con un promedio de 20±3.61 células vegetativas  y se encuentran de forma intercalada entre la células vegetativas. 

Figura 1.1 Anabaena sp. con un heterocisto rodeado de células vegetativas 40x.

• Presencia de heterocistos los cuales se desarrollan a partir de células vegetativas y pueden encontrarse en hilera. Los heterocistos se desarrollan exclusivamente en la parte apical o terminal de las células vegetativas o intercaladamente. (Fig.1.2)

Figura1.2 Anabaena sp. con heterocistos ubicados intercaladamente 40x.

• La Anabaena sp. presenta inhibición de crecimiento a 20g/L de sal, sobrevive a 10 y 15g/L y presenta un mayor desarrollo a 0 y 5g/L.
• Algunos tricomas se observan rectos y otros ligeramente sinuosos y sus células terminales tienen forma cónica.






Importancia Ambiental

   La cianobacteria en cuestión es capaz de detectar de forma general cualquier tipo de elemento ambiental perjudicial que le suponga un destrucción en su actividad metabólica, dicho detrimento se traduce en una disminución de la emisión de luz de la cianobacteria, lo que se utiliza como indicador de toxicidad ambiental. Dicha propiedad luminiscente se emplea ya de forma rutinaria para la medida rápida de toxicidad de muestras ambientales de toda índole (aguas fluviales, efluentes de depuradoras, aguas marinas, subterráneas, suelos, etc.)

La presencia de metales  pesados (contaminantes) se incrementa a cierto nivel en el medio extracelular, se activan los sistemas de luminiscencia de la bacteria.La cepa Anabaena sp. posee la capacidad autolumiscente que permite, además de detectar la parte biodisponible del contaminante (Zinc, Plata, Cobre, Cadmio, y Mercurio), indicando una respuesta de forma analítica a partir de un biosensor (de una biomolecula).  

La  Anabaena sp. es una de las bacterias mayormente utilizadas  para la investigación por su elevada estabilidad de su biomasa, la fácil extracción de sus pigmentos y exopolisacáridos en cultivos discontinuos y semicontinuos, favorecen su selección para estudios inherentes a la optimización de condiciones ambientales para la producción de pigmentos, proteínas y de otros compuestos de importancia comercial.

Otra aplicacion es su utilidad como biofertilizante en cultivos anuales y perennes con diferentes sistemas de manejo debido a sus importantes y multiples funciones en la agricultura, como en la nutricion de los cultivos, especialmente con nitrógeno y fósforo. El uso de estos productos a mejorado la comprensión de la relación planta-micrfoorganismo en su contrubución a minimizar los riesgos de degradacion de los suelos y a maximizar el regreso de energía a los sitemas de producción. Estas consideraciones han tomado importancia en las últimas tres décadas para establecer fronteras a la agricultura, no sólo desde el punto de vista de lograr una máxima producción sostenida, sino buscando la estabilización de los sistemas de producción a largo plazo.

Debido a que durante su vida fija nitrógeno y cuando muere este nitrógeno fijado puede ser utilizado por las plantas a su alrededor. También poseen un importante papel como fuente de alimento para peces y aves acuáticas. 

Nutrición y Hábitat Natural

La Anabaena es un alga autótrofa, ya que realiza la fotosíntesis que posee clorofila a y c carotenoides, xantofilas y ficobilinas. Tiene alto contenido proteico además de carbohidratos y lípidos.

Requieren de períodos de luz y oscuridad, por lo cual, muchos aspectos de la fisiología microalgal requieren de esta periodicidad. Algunos aspectos fisiológicos que requieren periodicidad son:

La luz es indispensable para el crecimiento de las cianobacterias ya que necesitan de esta para su crecimiento:

• Divisón celular: La división celular ocurre en momentos determinados del día o la noche, hecho por el cual necesitan de la sincronización de la luz.
• Capacidad fotosintética: Se observa con frecuencia una mayor tasa de fotosíntesis en la mañana.
• Absorción de nutrientes: Se ha observado en el día mayor tasa de absorción de nitrógeno y fósforo.

El pH y temperatura no influyen en gran  manera en el crecimiento de la Anabaena ya que este se mantiene sostenido entre pH de 6.0 – 8.0 y una temeratura de 28±2ºC por lo tanto es otro parámetro que no influiría mayormente en el desarrollo de esta cianobacteria. Pero se evalúa su crecimiento únicamente con variación de concentraciones de sal.

El hecho de que la Anabaena  sp. muestre un excelente crecimiento en agua no salina y a 5g/L de sal, sugiere una alta eficiencia para colonizar ambientes no salinos y agua marina costera cercana a ríos o que posea salinidades bajas.

Forman blooms en agua dulce, aguas saladas, y varias especies suelen ser encontradas en el suelo, algunas son capaces de vivir en ambientes extremos.



Tipo de microorganismo

Las Cianobacterias son organismos procariotas del dominio bacteria y viene de  una división del reino Monera que comprende las bacterias capaces de realizar fotósintesis oxigenica. Las bacterias tienen células poco complejas, carecen de orgánulos delimitados por la membrana, es decir, no presentan núcleo,  mitocondrias, ni cloroplastos, etc.  

La Anabaena sp. alcanza un promedio mayor de densidad celular a 10g/L de sal.

La Anabaena sp. se encuentra en formas  unicelulares así como también en formas filamentosas, de varios tamaños  0,5 - 1 um hasta 60 um.

Se las divide en 5 grupos morfológicos:

1.   Unicelulares que se dividen por fisión binaria,

2.   Unicelulares que se dividen por fisión múltiple,

3.   Filamentosas con células especiales fijadoras de nitrógeno o heterocistos, Filamentosas pero sin heterocistos,

4.   Filamentosas ramificadas.  En su pared celular presentan peptidoglucano de estructura similar a las gram negativas.

5.   Poseen una sola forma de clorofila que es la clorofila a, encontrado en la  Anabaena sp. aislada  y reproducida a 5g/L de sal, supone una elevada actividad fotosintética, donde cada una tiene pigmentos biliprotéicos o ficobilinas que son pigmentos accesorios para el proceso fotosintético.

Nombre Cintifico del Microorganismo

 

Phylum: Cianobacteria

Clase I: Cianobacteria

Subsección IV: Anabaena

División: Cyanophyta

Familia: Noctocaceae.

Orden: Noctocales

La Anabaena es un tipo de género de las cianobacterias, que pertenece a la familia Noctocaceae (anteriormente se dominaban algas verde-azuladas) de reproducción asexual y es autótrofa por tener clorofila dispersa.

Célula procariota con su ubicación dentro del reino procariote.